《水质 灭菌指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定 生物学检测法（征求意见稿）》编制说明

1 项目背景

1.1 任务来源

      2012 年 4 月，原国家环境保护部办公厅发布了《关于开展 2012 年度国家环境保护标准制修订项目工作的通知》（环办函〔2012〕503 号），由上海市环境监测中心承担《水质  指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》项目的制订工作。项目统一编号为 2012-54。

1.2 工作过程

1.2.1 成立标准编制组

      任务下达后，上海市环境监测中心作为承担单位成立了标准编制组，成员以多年从事微生物监测工作的人员为主。

1.2.2 相关标准和文献资料调研

      2012 年，通过国内外相关分析方法比较研究，分析总结枯草芽孢杆菌黑色变种测定的技术特点和问题、技术发展趋势、新技术的可行性；结合相关法律、法规和政策的研究和分析，提出标准制修订的必要性，完成标准开题论证报告和标准草案的编写。

1.2.3 召开研讨会，研究建立标准方法，开展方法研究

      按照标准制定要求，参考相关标准和资料，召开研讨会，就标准编制的重难点进行讨论， 最终确立实验方案。于 2012 年～2014 年开展了标准方法研究试验和适用性试验。

1.2.4 开题论证，确定标准制定的技术路线和原则

      2014 年 4 月 7 日，标准开题论证报告和标准草案通过了环保部科技标准司组织的开题论证会，并提出了修改建议：将标准适用范围确定为“含活性微生物废水经灭菌处置后，枯草芽孢杆菌黑色变种的测定”；调整检测方法程序，先筛查后鉴定；根据相关排放标准要求， 确定合理的样品取样量。

1.2.5 落实专家意见，深入开展方法试验研究

      2014 年 5 月～2015 年 6 月，根据开题论证意见，标准编制组按照《国家环境保护标准制修订工作管理办法》（国家环境保护总局 2006 年第 41 号）、《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》（HJ 168-2010）等文件的要求开展和增加相关试验；并准备实验室方法验证工作，着手编写《水质 指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》标准征求意见稿及方法验证方案。

1.2.6 方法验证工作

      2016 年 03 月～2016 年 6 月，组织 6 家有资质的实验室进行方法验证，于 2016 年 6 月收回所有的验证报告，随后进行了数据的汇总和整理分析工作，编制《水质 指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》验证报告。

1.2.7 标准征求意见稿和编制说明

      2016 年 6 月～2016 年 12 月，完善《水质 指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》征求意见稿并编写标准编制说明。

1.2.8 标准研讨会

      2017 年 1 月 13 日，于北京召开了《水质 指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》标准编制工作的研讨会，经质询和讨论，形成意见：将适用范围修改为“本标准适用于含活性微生物废水经灭菌处置后的灭菌指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学检测”；标准文本中 3 方法原理内容建议进一步详述；标准文本中 4 试剂和材料内容进行部分修改；标准文本的部分注解、引用等文字进行适当更正。

1.2.9 标准征求意见稿编制

      2017 年 1 月～2018 年 6 月，修改完善《水质 指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》标准征求意见稿及编制说明，并进行了专家函审。

1.2.10 召开标准征求意见稿技术审查会并根据审查意见修改

      根据生态环境保护部环境监测司要求，于 2018 年 7 月 6 日召开了《水质 指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的测定 生物学检测法》标准征求意见稿技术审查会，审查专家提出了将标准名称改为《水质 灭菌指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定  生物学检测法》，明确方法适用范围，完善方法原理、干扰和消除的表述，在样品采集中增加干扰和消除的步骤，补充芽孢染色镜检的描述和图例，质量保证和质量控制中细化试剂和培养基质量控制要求等审查意见，编制组根据专家审查意见，修改标准名称，对文本相应内容进行修改和补充。

2 标准制修订的必要性分析

2.1 监测意义

2.1.1 枯草芽孢杆菌黑色变种基本情况

      “枯草芽孢杆菌黑色变种 Bacillus subtilis var. niger”，由美国的 Elizabeth 最先分离得到，因其在含酪氨酸的培养基上产棕黑色素而得名。1989 年，Nakamura 依据 DNA 相似性研究，提议将包括“枯草芽孢杆菌黑色变种”在内的菌株划分为新的一个种，2001年该种被学术界承认和接受，命名为“萎缩芽孢杆菌”。

      Nakamura 将萎缩芽孢杆菌的形态特性归纳为：营养细胞杆状，单个或短链状排列，革兰染色为阳性；细胞宽 0.5μm～1.0 μm，长 2.0μm～4.0 μm，可运动；芽孢椭圆形、中生、不膨大。生化特性包括：好氧生长，V-P 反应阳性（V-P 培养基中培养，pH 范围为 5.3～5.7， DNA 浮力密度为 1.6946 g/cm3～1.6966 g/cm3，G+C 含量为 41 mol%～43 mol%。产过氧化氢酶，不产氧化酶、硫化氢、吲哚、二羟基丙酮；利用阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖醇、水杨苷、蔗糖、海藻糖和木糖发酵后产酸不产气，利用纤维二塘、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、核糖、甲基戊糖和ft梨糖醇产酸的过程不稳定。可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，水解淀粉和酪蛋白，利用柠檬酸盐，消化吸收酪蛋白；不能利用丙酸盐，不能发酵乳糖和蜜二糖，不能分解蛋黄卵磷脂、吐温-80、尿素、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸；在石蕊牛乳中 pH 呈碱性。最适宜生长温度为 28～30℃，最高生长温度为 50℃～55℃，最低生长温度为 5～10℃，在 pH 为 5.6 或 5.7，含 7%NaC1 条件下生长，在含有 0.001%的溶解酵素情况下，生长被抑制。

      而本标准为了便于国内应用与识别，仍称“枯草芽孢杆菌黑色变种”， 其分类地位见下图 1，代表菌株编号 ATCC 9372。

      >细菌

           >厚壁菌门

                 >杆菌

                       >芽孢杆菌目

                             >芽胞杆菌科

                                    >芽孢杆菌属

                                           >枯草芽孢杆菌群

                                                  >枯草芽孢杆菌黑色变种

​图1 枯草芽孢杆菌黑色变种分类地位

2.1.2 检测意义

      枯草芽孢杆菌黑色变种作为枯草芽孢杆菌亚种，本身不具有危害性，因能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学物质很强抗性的芽孢，可以作为消毒剂检测及灭菌质量控制方面的质量控制标准菌株进行应用。

      《美国药典》将枯草芽孢杆菌黑色变种作为干热消毒、环氧乙烷控制的生物指示剂及用于医药物品消毒与无菌保证；《欧洲药典》将其作为杀菌法的生物指示剂；我国在《中国药典》、《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB 15981-1995)、《消毒技术规范》均将枯草芽孢杆菌黑色变种作为消毒灭菌指示微生物；英国、瑞士等国标准协会在健康产品相关的标准或与医疗器械相关的标准中已将该菌株作为环氧乙烷灭菌、干热灭菌和其它液体化学消毒剂的指示剂。

      此外，枯草芽孢杆菌黑色变种也可作为炭疽杆菌的非致病性替代物，用于军事等方面研究；用于生产生物表面活性剂，在环境保护、有机物质处理和油回收等领域[8]具有广阔的应用；用于芽孢形成、萌发、耐热机理等研究领域；在分布媒介、净化模拟及大范围过程开发等领域也有着重要的研究意义。美国模式培养物保藏所将枯草芽孢杆菌黑色变种菌株的作用总结为：抗性测试、效力试验、环氧乙烷消毒、蒸汽消毒、介质测试、无菌测试及消毒控制。

      综上所述，枯草芽孢杆菌黑色变种在消毒剂检测及灭菌质量控制方面具有广泛的应用，而本标准的制定，对水环境卫生安全的监测和评价十分关键。

2.2 相关环保标准和环境工作的需要

      医疗废物监控的需要。为加强医疗废水排放的管理，有效截断各种传染病的传播途径， 国务院颁布了《医疗废物管理条例》，明确规定医疗卫生机构产生的污水、传染病病人或者疑似传染病病人的排泄物，应当按照国家规定严格消毒，达到国家规定的排放标准，主要污染物应严格执行《污水综合排放标准》（GB 8978-1996）才可排放。《全国危险废物和医疗废物处置设施建设规划》第二章技术要求中指出，“小于 10 吨/日的医疗废物处置设施，必须做到杀菌、灭活、毁形和无害化，防止二次污染”。

      病原废水监控的需要。2000 年 6 月由原建设部、国家环保总局、科技部联合发布的“关于印发《城市污水处理及污染防止技术政策》的通知”中规定：“为保证公共卫生安全，防止传染性疾病传播，城市污水处理设施应设置消毒设施”。此外，《城镇污水处理厂污染的排放标准》(GB l8918-2002)中首次将微生物指标列为基本控制指标，规定污水处理厂出水必须进行消毒处理，从而使我国污水处理标准的病理指标与国际接轨。目前，国内所有的污水处理厂必须设置消毒设施，常见的废水消毒处理方法见表 1。

表1 废水消毒方法比较

      病原微生物消毒监控的需要。《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》（GB 19489）等有关规定，对涉及生物安全的废水、废液、废气等进行灭活灭菌后才能排放，灭活灭菌方法应符合《消毒技术规范》的规定。《中华人民共和国传染病防治法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第 424 号）、《医院感染管理规范》等法律规范规定：污染物必须进行消毒、灭菌效果定期检测。常见病原菌灭菌条件见表 2。

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