1适用范围
本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。
2规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T 6920水质pH值的测定玻璃电极法
GB/T 13267水质 物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法
HJ 91.1污水监测技术规范
HJ 506水质 溶解氧的测定 电化学探头法
HJ/T 91地表水和污水监测技术规范
HJ/T 164地下水环境监测技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
鱼卵fish egg
指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞，斑马鱼卵相关发育阶段参见附录A。
3.2
稀释倍数dilution level
原水样占稀释后水样总体积分数的倒数，一般用D来表示。例如，水样未稀释，则稀释倍数D=1；取250 ml水样稀释至1000 ml（即体积分数为25%），则稀释倍数D=4。
3.3
最低无效应稀释倍数lowest ineffective dilution
测试中不产生测试效应的最低稀释倍数，本标准指不少于90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数，用LID表示。
3.4
半数效应浓度EC50
指暴露48 h后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数，用EC50表示。本标准中EC50即半数致死浓度LC50。
3.5
参比物质reference substance
测试中，用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质，如本标准中3,4-二氯苯胺。
4方法原理
使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将4-细胞期～128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在26℃±1℃的条件下培养48 h，根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算LID或EC50值，表征水样的急性毒性。
5干扰和消除
水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8） 中吸出一定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴管（7.11）将原水样移回，恢复原有暴露体积。
6试剂和材料
6.1受试生物
6.1.1种鱼
使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长3.5 cm左右，鱼龄在6月～24月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前6个月不予使用任何药物。种鱼驯养及维持具体条件见附录B。
6.1.2鱼卵
确保试验鱼卵受精率≥70%，处于4-细胞期～128-细胞期（见附录A）。
6.2试剂
除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水，满足pH值6.5～8.5，电导率＜10μS/cm的要求。
6.2.1氢氧化钠（NaOH）。
6.2.2氯化钙（CaCl2·2H2O）。
6.2.3硫酸镁（MgSO4·7H2O）。
6.2.4碳酸氢钠(NaHCO3)。
6.2.5氯化钾（KCl）。
6.2.6 3,4-二氯苯胺（C6H5Cl2N），优级纯。
6.2.7盐酸：ρ（HCl）=1.19 g/ml。
6.2.8盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
量取8.3 ml盐酸（6.2.7），用水定容至1 000 ml。
6.2.9氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1 mol/L。
称取4 g氢氧化钠（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至1 000 ml。
6.2.10参比物质3,4-二氯苯胺储备液：ρ（C6H5Cl2N）=100 mg/L。
称取0.05 g 3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水（6.2.16）定容至500 ml，静置24 h，调节pH值至7.0。避光冷藏保存，储备液可储存6个月。
6.2.11参比物质3,4-二氯苯胺工作液：ρ（C6H5Cl2N）=3.7 mg/L。
量取3.7 ml参比物质3,4-二氯苯胺储备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水（6.2.16）定容至100 ml，使用前按8.2.1步骤平衡至26℃±1℃。该溶液作为阳性对照，临用前现配。
6.2.12氯化钙储备液：ρ（CaCl2·2H2O）=11.76 g/L。
称取11.76 g氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至1 000 ml。可储存6个月。
6.2.13硫酸镁储备液：ρ（MgSO4·7H2O）=4.93 g/L。
称取4.93 g硫酸镁（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至1 000 ml。可储存6个月。
6.2.14碳酸氢钠储备液：ρ（NaHCO3）=2.52 g/L。
称取2.52 g碳酸氢钠（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至1 000 ml。可储存6个月。
6.2.15氯化钾储备液：ρ（KCl）=0.22 g/L。
称取0.22 g氯化钾（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至1 000 ml。可储存6个月。
6.2.16标准稀释水。
将氯化钙储备液（6.2.12）、硫酸镁储备液（6.2.13）、碳酸氢钠储备液（6.2.14）和氯化钾储备液（6.2.15）四种储备液各25 ml混合，用水定容至1 000 ml。
7仪器和设备
7.1冷藏采样箱：2℃～8℃；
7.2 pH计：测量范围0～14，最小分度为0.1 pH单位；
7.3溶解氧测定仪：测量范围0 mg/L～20 mg/L，最小分度为0.1 mg/L；
7.4倒置显微镜或体视显微镜：最小放大倍数为30×；
7.5冰箱：冷藏室2℃～8℃；冷冻室≤-18℃；
7.6恒温培养箱或恒温室：温度可调至26℃±1℃；
7.7斑马鱼养殖系统：包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统；
7.8多孔细胞培养板：每孔容积2.5 ml～5 ml或采用其它相同功能的细胞培养板，可选择市售；
7.9产卵盒：惰性材料，推荐尺寸：20 cm×10 cm×11 cm（参见附录C），可选择市售；
7.10温度计：0℃～50℃；
7.11塑料滴管：5 ml，口径大于3 mm；
7.12一般实验室常用器皿和设备。
8样品
8.1样品的采集和保存
根据样品性质及监测需要使用1 000 ml及以上容量的棕色玻璃瓶（或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器）按照HJ 91.1、HJ/T 91或HJ/T 164的要求进行水样的采集，水样沿瓶内壁缓慢倒入，并与瓶塞间不留空隙。
水样采集后，立即于2℃～8℃避光运输和保存，并尽快进行试验，保存时间最长不超过48 h。水样若需长期保存，则上述水样采集后应尽快送回实验室冷冻（≤-18℃）保存， 保存前将水样充分混匀后按每1000 ml容器盛装500 ml～700 ml水样的量分装，保存期不超过2个月。
8.2样品预处理
8.2.1温度
冷冻保存的水样需在不超过25℃水浴轻微振荡解冻，或在2℃～8℃冷藏过夜解冻。受试水样在试验开始前，放置于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，26℃±1℃避光平衡至恒温后用于试验。
8.2.2 pH值
按照GB/T 6920方法测定水样pH值。当pH值＜6.5或pH值＞8.5时，使用盐酸溶液（6.2.8）或氢氧化钠溶液（6.2.9）调节水样pH值至6.5～8.5，尽量减少酸碱调节液的用量， 以减少对水样浓度的影响。测定并记录调节后的水样pH值，按后续步骤进行水样测定。
当pH值的影响需要反映在试验结果中或者调节pH值会引起水样物理变性或化学反应时，则不调节水样pH值。
根据水样测定的实际需求，也可对pH值调节前后的水样同时开展试验比较。
8.2.3溶解氧
按照HJ 506方法测定水样溶解氧浓度，确保用于暴露试验（9.3）步骤中的每个稀释水样中初始溶解氧浓度不低于4 mg/L（大约50%饱和度）。若要充氧，溶解氧浓度不超过相应饱和溶解氧值。
8.3样品稀释
8.3.1预实验
当浓度难以预估时需进行预试验，以稀释比为10选择3个连续浓度的稀释水样，每一浓度以5粒鱼卵按9.3～9.6部分进行试验，以确定鱼卵死亡率100%～0%与稀释水样浓度大致对应的范围。
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